一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

NO（Nitric Oxide，NO）广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。

测定原理：

NO在体内或水溶液中极易氧化生成 NO^2-，在酸性条件下，NO^2-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。为了排除样品色素等的影响，每个样品需做对照管。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵或匀浆器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

样品处理：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心 15min，取上清置于冰上待测。

3. 体液和培养液等其它液态样品：直接测定。

测定步骤和操作表：

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm。

2、 操作表

NO 含量计算：

a.  用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y=0.016x-0.0103，R²=0. 9986

1、组织样品：

NO含量定义：25℃时，每克样品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO^2-，相当于1μmoL NO。

（1）按样本质量计算

NO 含量（μmoL/g）=（A 550 +0.0103）÷0.016×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）×10 ^-3

= 0.125×（A 550 +0.0103）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

NO 含量（μmoL/mg prot）=（A 550 +0.0103）÷0.016×V 反总÷（V 样×Cpr）×10 ^-3

= 0.125×（A 550 +0.0103）÷Cpr

2、其他样品：

NO 含量定义：25℃时，每升样品15min生成 1μmoL NO^2-，相当于1μmoL NO。

NO 含量（μmoL/L）=（A 550+0.0103）÷0.016×V 反总÷V 样

= 125×（A 550+0.0103）

V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样品体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y= 0.008x-0.0103，R²=0. 9986

1、组织样品：

NO含量定义：25℃时，每克样品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO^2-，相当于1μmoL NO。

（1）按样本重量计算

NO 含量（μmoL/g）=（A 550 +0.0103）÷0.008×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）×10 ^-3

= 0.25×（A 550+0.0103）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

NO 含量（μmoL/mg prot）=（A 550+0.0103）÷0.008×V 反总÷（V 样×Cpr）×10 ^-3

= 0.25×（A 550+0.0103）÷ Cpr

2、细胞

NO 含量定义：25℃时，每10⁴个细胞15min 生成 1μmoL NO^2-，相当于1μmoL NO。

NO 含量（μmol/10⁴cell）=（A 550+0.0103）÷0.008×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）×10 ^-3= 0.25×（A 550+0.0103）÷细胞数量（万个）

3、 其他样品：

NO 含量定义：25℃时，每升样品 15min 生成 1μmoL NO^2-，相当于1μmoL NO。

NO 含量（μmoL/L）=（A 550 +0.0103）÷0.008× V 反总÷V 样= 250×（A 550 +0.0103）

V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样品体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，

1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL