α-淀粉酶（α-AL）活性检测试剂盒说明书  微量法

规格：100T/48S

产品内容：

试剂一：液体 20mL×1 瓶，室温保存。若有黄色晶体析出，可适当加热溶解后再用。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解。

标准品：粉剂×1 支，10mg 无水葡萄糖，临用前加 1mL 蒸馏水，配成 10mg/mL 葡萄糖标准液。

产品说明：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在 540 nm 有吸收峰；通过测定 540 nm 吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL 耐热，但是β-淀粉酶可在 70℃ 钝化 15min。因此粗酶液经过 70℃钝化 15min，就只有α-AL 能够催化淀粉水解。

需自备的仪器和用品：

酶标仪或可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96 孔板/微量比色皿、研钵和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约 0.1g 样本，加 0.8 mL 蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取 15min，每隔 5min 振荡 1 次，使其充分提取；6000g，室温离心 10min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。

二、测定步骤和加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。

2、将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078 和

0.0039mg/mL 的标准溶液。

3、按操作表依次加入各试剂：

混匀，90℃ 水浴 10min，取 200μL 至 96 孔板或微量比色皿中，540nm 处读取对照管、测定管、标准管、空白管的吸光度，分别记为 A 对照、A 测定、A 标准和 A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

三、α-淀粉酶活性计算：

1、标准曲线的绘制

以ΔA 标准为 y 轴，以标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b。将ΔA 测定带入方程得到 x（mg/mL）。

2、α- 淀粉酶活性的计算

a. 按照样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟催化产生1mg 还原糖定义为1 个酶活力单位。

α- 淀粉酶活性(mg/min/g 鲜重)=x×V 样÷(W×V 样÷V 样总)÷T=2×x÷W

b. 按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生1mg 还原糖定义为1 个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= x×V 样÷（V 样×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V 样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V 样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T：反应时间，5min。

注意事项：

当测定的吸光值大于 1.5 时，可以对样本进行适当稀释后测定。