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显色和比色在ELISA试剂盒实验中有哪些影响?


上海瑞番生物科技有限公司 /2021-02-09

ELISA试剂盒有着准确性高、灵敏度高、特异性强等很多的优点,它在检测抗体、抗原等方面有很好的应用,深受广大用户朋友的喜爱。然而,在实验过程中,也需要注意很多问题,特别是显色、比色问题。

  ELISA知识要点显色和比色分析:

  显色

  显色是ELISA中的后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色状况适当缩短或延长反应时间,及时判断。

  OPD(邻ben二胺)底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深,再延长反应时间,可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色,显色反应应避光进行,ELISA试剂盒显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后,显色由橙黄色转向棕黄色。

  TMB(四甲基联ben胺)受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

  比色

  比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标准96孔的座架中,才可进行比色。在加底物液显色前,先将软板边缘剪净,这样,此板就可完全平妥坐入座架中。

  比色时应先以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。

  比色结果的表达以往通用光密度(oplicaldensity,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为“A492nm"或“OD492nm"。


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